Oncologie

Large Résistance due aux AmpC β-lactamases à médiation plasmidique dans les isolats cliniques d’Escherichia coli

Escherichia coli qui produisent des β-lactamases AmpC plasmidiques sont rares aux États-Unis. Les caractéristiques cliniques associées à l’infection par ces organismes n’ont pas été bien décrites. Nous avons identifié des isolats cliniques d’E. Coli qui ont produit l’enzyme AmpC β-lactamase CMY. – Ces organismes ont été récupérés à partir d’échantillons d’urine et étaient résistants à la ceftazidime, à la ceftriaxone et au céfépime. Un isolat était résistant à l’ertapénème mais sensible à l’imipénème et au méropénème; l’autre était sensible à l’imipénème, au méropénem et à l’ertapénème. Un des patients infectés n’a pas nécessité de traitement spécifique; l’autre imipénème requis pour la guérison La présence de la CMY-β-lactamase a été confirmée par séquençage d’ADN Des études d’hybridation ont confirmé que le gène blaCMY- était sur un plasmide dans les deux isolats; dans l’un d’entre eux, la sonde s’est également hybridée avec l’ADN chromosomique. L’infection par des β-lactamases AmpC plasmidiques dans E. coli aux Etats-Unis peut être associée à un échec thérapeutique, et ces souches peuvent devenir une menace nosocomiale sérieuse

Des β-lactamases à plasmides qui hydrolysent les céphalosporines à spectre étendu, à savoir les β-lactamases à spectre étendu, ou BLSE ont été signalées dans le monde entier Les bacilles à Gram négatif contenant des BLSE sont de plus en plus courants dans de nombreux pays, notamment aux États-Unis. Les bactéries entériques qui possèdent des BLSE sont généralement sensibles aux combinaisons d’un β-lactame et d’un inhibiteur des β-lactamases. La plupart des BLSE sont des β-lactamases de classe A qui n’hydrolysent pas les céphamycines ou les carbapénèmes Les β-lactamases de Bush Medeiros Jacoby ou les β-lactamases de classe C, qui sont présentes dans les espèces Enterobacter, Serratia, Pseudomonas aeruginosa, Citrobacter freundii et Proteus, posent un problème thérapeutique depuis de nombreuses années En revanche, présence du gène chromosomique blaAmpC d’Escherichia coli conduit généralement à une production minimale de β-lactamase, car le promoteur est faible Chez les bactéries gram-négatives, ces enzymes de classe C confèrent une résistance à la plupart des céphalosporines et c les éphamycines et sont relativement résistantes à l’inhibition par les inhibiteurs de la β-lactamase Au cours de la dernière décennie, un nouveau problème est apparu dans les bactéries entériques: les enzymes AmpC plasmidiques dérivées des gènes chromosomiques AmpC de C freundii les enzymes CMY-A, LAT-, et BIL-, Enterobacter cloacae MIR-, et P aeruginosa MOX- et FOX- Les organismes qui possèdent ces β-lactamases semblent être rares aux États-Unis Les caractéristiques cliniques associées à l’infection par ces organismes n’ont pas été bien décrit Nous avons récemment détecté des isolats cliniques d’E. coli qui ont produit des enzymes AmpC plasmidiques, et nous rapportons leurs caractéristiques cliniques et microbiologiques associées.

Patients et méthodes

Patiente Une femme âgée d’un foyer de soins et souffrant d’une maladie du foie en phase terminale due à l’alcoolisme a été admise à l’hôpital avec une encéphalopathie hépatique et des antécédents de somnolence. L’histoire du patient était également marquée par des bactéries spontanées récurrentes. péritonite; En tant que traitement, elle recevait un traitement suppressif à long terme par lévofloxacine mg par voie orale Elle était afébrile et présentait des signes d’ascite Elle était vigilante et combative L’analyse d’urine n’a pas révélé de pyurie ou de bactériurie. La paracentèse n’a pas révélé d’ascite neutrophilique. deuxième jour de son séjour à l’hôpital, le patient est devenu hypothermique; Un traitement empirique avec la vancomycine et la ceftriaxone a été initié pour une septicémie présumée Enterococcus faecalis a été récupéré à partir de cultures sanguines La thérapie a été remplacée par l’ampicilline intraveineuse et la réponse a été satisfaisante Une culture urinaire a révélé E coli désigné comme l’isolat « M » sensible aux aminoglycosides, imipénème Cependant, le patient ne présentait aucun signe ou symptôme d’infection urinaire. Aucune thérapie spécifique n’a été administrée, et des cultures d’urine de suivi effectuées pendant que le patient recevait un traitement à l’ampicilline n’ont rien révélé d’anormal.Patient Un homme indien âgé atteint de cystite glandulaire À notre arrivée à notre centre, il était afébrile, et l’analyse d’urine n’a montré aucune preuve d’infection. Il a subi une réimplantation urétérale bilatérale élective avec En périopératoire, il a été traité avec int Ampicilline vénéneuse, gentamicine et métronidazole Au jour postopératoire, il a développé une température de ° C. L’analyse des urines a révélé de nombreux globules blancs, et des cultures de sang et d’urine ont donné l’isolat « M » qui était sensible seulement à la nitrofurantoïne, à la pipéracilline. -tazobactam, imipénème, méropénem et ertapénème La patiente a continué à être fébrile jusqu’à l’instauration d’un traitement approprié par imipénem-cilastatine mg iv qh. L’imipénem-cilastatine a été interrompue après un traitement d’une journée et il n’y a pas eu de récidive pendant le séjour hospitalier.Sensibilité antibiotique Susceptibilité Le test a été réalisé avec le test Vitek bioMérieux et confirmé avec Microscan microdilution durant la nuit MIC panels Dade Behring Meropenem et ertapenem test a été réalisé avec la méthode du bouillon tube de macrodilution E coli ATCC a été utilisé comme témoin Extraction des β-lactamases et isoélectronique analytique aIEF Extraits de membranes bactériennes brutes contenant de la β-lact Des amas ont été préparés par une version modifiée de la méthode de Matthew et al. En bref, les cultures de bouillon de soja trypticase des isolats ont été soumises à une ultrasonication pendant une nuit au moyen d’une série de trois salves, avec refroidissement de la glace entre les salves. les extraits ont ensuite été testés pour l’activité β-lactamase avec l’utilisation de μg / mL de nitrocefin Becton Dickinson et observés pour le changement de couleur caractéristique aIEF a été réalisée avec des gels de polyacrylamide contenant du pH d’ampholine, -; Amersham Pharmacia Biotech, selon les instructions du fabricant Des extraits de β-lactamase d’isolats connus pour produire les enzymes TEM, CMY- et SHV ​​ont été utilisés comme témoins L’identification des bandes de β-lactamase a été facilitée par superposition du gel avec de la nitrocefine à une concentration de μg / mLConjugation, analyse plasmidique et hybridation Le transfert de l’ADN plasmidique supposé porter les marqueurs de résistance a été tenté avec l’utilisation de E coli C résistant à l’acide nalidixique et à la rifampicine et E coli J – résistant à l’acide nalidixique comme décrit ailleurs la préparation a été réalisée avec le plasmide QIAfilter Midi Kit Qiagen, selon les instructions du fabricant Ce test peut isoler des plasmides jusqu’à ~ kb en longueur Des études d’hybridation ADN ont également été réalisées sur les isolats L’ADN plasmidique a été transféré à une membrane en nylon par le test Southern blot, comme décrit ailleurs E coli J–, qui est un transconjugant contenant un gène cloné codant pour l’enzyme C MY-AMH et RAB, données non publiées, ont été utilisées comme modèle pour générer une sonde PCR -bp avec utilisation des amorces AmpF et AmpR table La sonde a été marquée avec digoxigénine-‘-désoxyuridine’ -triphosphate Roche Molecular Biochemicals par random marquage amorcé, et l’hybridation a été réalisée à ° C, suivie de lavages de stringence à ° C et ° C, selon les instructions du fabricant

Diapositives nucléotidiques des oligonucléotides utilisés pour l’amplification PCR et le séquençage de l’ADNTable View largeTexte des séquencesNucléotides des oligonucléotides utilisés pour l’amplification PCR et le séquençage de l’ADNPCR, clonage et séquençage nucléotidique de l’amplification PCR CMY-β-lactamase pour les isolats M et M a été réalisée avec l’utilisation des amorces internes, AmpF et AmpR, pour amplifier un tableau de fragments -bp Une aliquote de -μL d’une culture d’une nuit a été diluée: avec de l’eau et bouillie pendant min amplification PCR a ensuite été réalisée avec l’utilisation de μL de cette dilution comme Gabarit d’ADN Les conditions de PCR comprenaient des cycles d’amplification, avec dénaturation à ° C pendant min, hybridation à ° C pendant min, extension à ° C pendant min, et une extension finale à ° C pour les produits de PCR min ont été réalisées sur% gels d’agarose, qui ont été colorées avec du bromure d’éthidium et photographiées avec une illumination ultraviolette Le marqueur ΦX ADN RF / HaeIII fragments Gibco BRL, Life Technologies wa s utilisé pour évaluer la taille du produit PCR Pour le séquençage, les produits PCR ont été purifiés avec le kit de purification QIAquick PCR et QIAEX II Qiagen Le séquençage du fragment -bp obtenu a été réalisé avec les amorces AmpF et AmpR sur un séquenceur d’ADN AB Prism Perkin-Elmer, et les séquences ont été analysées avec le logiciel Chromas, la version Conor McCarthy, Griffith University, Brisbane, Queensland, Australie et Omiga, version Oxford MolecularBoth Les brins du produit PCR ont été séquencés Le séquençage du fragment a suggéré une β-lactamase de type AmpC blaCMY- La longueur totale du gène, kb a ensuite été amplifiée en utilisant des amorces AmpF et AmpR Integrated DNA Technologies table Le fragment -kb a été clone dans un kit de clonage PCR pCR-XL-TOPO TOPO XL; Le gène blaCMY entier a été séquencé par l’utilisation du transformant contenant le fragment sous-cloné. Les réactions de séquençage ont été réalisées avec le kit de séquençage du cycle d’amorce marqué par fluorescence Thermosequenase Amersham Pharmacia Biotech avec marquage Cy- end avant et inverse. amorces, exécutées sur le séquenceur automatique ALF express Amersham Pharmacia Biotech, et analysées avec le logiciel DNASIS Hitachi Genetic SystemsWestern blot testing et électrophorèse en champ pulsé PFGE Les isolats bactériens contenant la CMY-β-lactamase ont été cultivés pendant une nuit en mL de bouillon Luria-Bertani Becton Dickinson Cinquante microlitres de chaque culture ont été mélangés avec un tampon échantillon SDS-PAGE, résultant en une solution finale de pH base mM Tris,% glycérol,% SDS, dithiothréitol mM et% bromophénol bleu. Ces échantillons ont ensuite été bouillis et un échantillon de -μL a été soumis à l’électrophorèse et transféré aux membranes de polyfluorure de vinylidène Boehringer Mannheim Les membranes ont été bloquées pendant la nuit dans% de sérum albumine bovine Amresco avec pH mM salin tamponné par Tris-HCl pH; tampon de blocage, puis la présence de β-lactamase a été détectée par incubation du blot en μg / ml d’anticorps anti-CMY Genosys Custom Antibody Synthesis pour h à température ambiante Les membranes ont été lavées fois à chaque fois en solution saline tamponnée au Tris pH et incubées avec: une dilution de la protéine conjuguée à la peroxydase de raifort G Bio-Rad Toutes les incubations d’anticorps et de protéine G ont été effectuées dans du tampon de blocage Après plus de lavages, des membranes ont été traitées pour une exposition au film. Amersham Pharmacia Biotech, selon le protocole du fabricantLa limite inférieure de la reconnaissance des anticorps anti-CMY dans ces conditions est de ng de CMY purifiée. Nous avons précédemment démontré que l’anticorps anti-CMY développé ne reconnaît pas les anticorps TEM- ou SHV- β-lactamase mais reconnaît d’autres β-lactamases de classe C AMH et RAB, données non publiées En outre, le PFGE a été réalisé par digestion de l’ADN chromosomique par XbaI, comme décrit ailleurs

Résultats

Susceptibilité aux antibiotiques Les deux isolats étaient résistants à toutes les céphalosporines testées, y compris le céfépime, ainsi qu’aux pénicillines. L’isolat M était résistant à l’ertapénème MIC, μg / mL, mais était sensible au méropénem et à l’imipénème; l’isolat M était sensible à tous les carbapénèmes testés L’isolat M était résistant à la pipéracilline-tazobactam; isolat M était sensible Les deux isolats étaient résistants aux quinolones norfloxacine, ciprofloxacine et lévofloxacine

Tableau View largeTélécharger slide Sensibilité antibactérienne des isolats d’Escherichia coli M et MTable View largeDispositifDispositif antibactérien des isolats d’Escherichia coli M et MaIEF Les deux isolats ont produit des β-lactamases suggérant un point CMY-isoélectrique [pI], et TEM- pI, isolats M et M également produits β-lactamases supplémentaires, avec pI de et, respectivement, indiquant la présence d’une AmpC β-lactamase chromosomique de E coli pI, et un éventuel blaSHV variant pI, Conjugaison, analyse plasmidique, et hybridation La conjugaison a échoué en raison de la résistance élevée Les sondes marquées à la digoxigénine s’hybridaient avec des plasmides et avec ce qui semble être la bande chromosomique chez M, et avec un plasmide dans l’autre isolat, M Ceci indique que résistance due à AmpC β-lactamase peut être une combinaison de production d’AmpC chromosomique et plasmidique a Le séquençage de l’ADN des produits amplifiés par AmpF et AmpR a démontré la présence d’une β-lactamase AmpC homologue du gène Salmonella senftenberg blaLAT- et du gène Klebsiella pneumoniae blaCMY- lorsque le gène de résistance est porté par plusieurs plasmides. le gène entier a été amplifié par les amorces AmpF et AmpR, la séquence nucléotidique s’est révélée identique au gène blaCMY- précédemment caractérisé dans les deux isolats Western blot testing et PFGE Les résultats du Western blot testing sont illustrés sur la figure. CMY-anticorps détecté la présence de la CMY-β-lactamase dans les isolats cliniques testés, M et M PFGE a révélé que les types d’isolats étaient des données différentes non montrées

Vue de la figure grandDownload slideBlocards occidentaux et occidentaux d’isolats d’Escherichia coli M et M Le transfert de Southern a été sondé avec un fragment connu du gène de l’enzyme CMY-, qui a été marqué avec du digoxigénine-désoxyuridine-triphosphate La sonde hybridée avec des bandes plasmidiques Le Western blot a été sondé avec μg / mL d’anticorps anti-CMY- et de protéine G conjuguée à la peroxydase de raifort pour détecter la présence de flèche CMY-β-lactamase. Voir en grandDownload slideSouder Western et Western blots des isolats d’Escherichia coli M et M Le transfert de Southern a été sondé avec un fragment connu du gène de l’enzyme CMY- marqué avec le digoxigénine-désoxyuridine-triphosphate. La sonde s’est hybridée avec des bandes plasmidiques flèches pleines et avec une bande chromosomique in M open arrow Le Western blot a été sondé avec μg / mL d’anticorps anti-CMY- et de protéine G conjuguée à la peroxydase de raifort pour détecter la présence de CMY- Flèche de β-lactamase

Discussion

Nous avons pu déterminer que la CMY-β-lactamase était codée sur des plasmides à la fois dans l’isolat M et dans l’isolat M, et nous avons pu déterminer l’identité de la pI-β-lactamase dans M et MU. Il est à noter que la séquence d’ADN de blaCMY- est homologue à celle de blaAmpC de E. coli. Nous croyons que cela explique pourquoi notre sonde s’est hybridée à la bande chromosomique de M identifiant blaAmpC Ceci serait également en accord avec nos découvertes aIEF qui suggèrent la présence de un AmpC chromosomique de E coli En outre, nous avons trouvé que la force du résultat sur le test de Western blot était plus grande pour la β-lactamase dans M que pour celle dans M Cela confirme également nos autres données, qui ont montré que AmpC β-lactamases étaient présent dans M blaCMY- et blaAmpC de E coli et que blaCMY- seul était présent dans les bacilles MGram-négatifs qui hébergent des β-lactamases AmpC plasmidiques semblent être rares aux États-Unis Coudron et al ont rapporté les résultats d’une étude cet ex isolats cliniques de E coli, K pneumoniae et Proteus mirabilis pour les enzymes AmpC plasmidiques Des isolats de E coli,% étaient résistants à la céfoxitine Selon les résultats de aIEF, de ceux-ci avaient une bande compatible avec celle d’une enzyme AmpC Ces enzymes n’étaient transférables sur un plasmide que dans certains cas. Il convient de noter que les β-lactamases AmpC peuvent être codées sur des gènes chromosomiques ou plasmidiques ou les deux, comme l’illustre l’un de nos isolats. Cela soulève des questions sur la façon dont blaAmpC a trouvé son chemin. plasmide Certains agents pathogènes entériques peuvent également être résistants à la céphamycine en raison des mutations de la porine La distribution géographique des β-lactamases AmpC à médiation plasmidique est remarquable Plusieurs groupes géographiques ont été décrits , notamment un groupe nord-américain de MIR et d’ACT; une grappe centrale de FOX et de FOX, une grappe asiatique de CMY et de MOX, et une grappe de travailleurs CMY, CMY, b, LAT et LAT en Méditerranée et au Moyen-Orient. Royaume a signalé une épidémie impliquant des patients, dont avait récemment visité le sous-continent indien Il est intéressant qu’un de nos patients était un immigrant récent de l’IndeWinokur et al ont isolé des souches CMY de Salmonella provenant d’animaux et de patients humains Dans une autre étude, ils ont trouvé des preuves que des plasmides porteurs de gènes de résistance au CMY étaient transférés entre différentes espèces bactériennes et que ces plasmides pouvaient être transmis entre des animaux destinés à l’alimentation et des humains [ ] Fey et al ont rapporté l’isolement de Salmonella résistante à la ceftriaxone chez un enfant et chez des bouses de bétail. La pharmacorésistance de ces isolats a été démontrée par la CMY-β-lactamase PFGE a révélé que les isolats récupérés chez l’enfant étaient étroitement apparentés. à ceux récupérés des bovins La présence de ces enzymes dans la chaîne alimentaire est inquiétante, et leur présence dans les salmonelles rais Le ceftriaxone est devenu le traitement de choix pour ces infections chez les enfants. Les enzymes AmpC induites par le plasmide peuvent conférer une large résistance à tous les β-lactamines autres que les carbapénèmes et représentent donc un défi thérapeutique majeur. Les carbapénèmes sont actifs contre les souches , mais plusieurs chercheurs ont décrit l’émergence d’une résistance due à un double mécanisme Bradford et al ont décrit la résistance à l’imipénème des isolats de K pneumoniae provenant de patients à New York. Ces organismes ont produit plusieurs β-lactamases, incluant une enzyme de type AmpC avec un pI de Le séquençage a révélé que cette enzyme, ACT-, était dérivée des espèces Enterobacter. Les transferts de Southern ont confirmé que blaACT était présent sur un grand plasmide et dans le chromosome de tous les isolats. Cette découverte est similaire à celle présentée ici. sur un transposon Tous les isolats manquaient également d’une protéine de la membrane externe -kDa, qui était présente chez les sujets sensibles à l’imipénème. À notre connaissance, la résistance à l’ertapénème n’a pas été décrite auparavant dans un isolat clinique d’E. coli. Des études mécanistes de la souche résistante à l’ertapénème que nous avons isolée sont en coursStapleton et al ont isolé des isolats d’E. Les études moléculaires ont montré que la résistance à la céphamycine était due à la CMY- plasmidique, tandis que la résistance au carbapénème était attribuable à la perte d’une protéine de la membrane externe-kDa. Les enzymes AmpC médiées semblent relativement rares aux États-Unis On ne sait pas si notre récente récupération de pathogènes hébergeant ces enzymes chez des patients en peu de temps indique une augmentation réelle de la prévalence ou une augmentation du taux de reconnaissance de ces pathogènes. est justifiée Bien que ces pathogènes soient rares, ils posent un problème de détection et de sélection de thérapie